Downregulation of the expression of inhibin α subunit and betaglycan in porcine cystic follicles

Inhibins, as members of the transforming growth factor beta (TGF-β) superfamily, downregulate the synthesis and secretion of follicle-stimulating hormone (FSH) in an endocrine manner. The role of inhibin/betaglycan in the ovary regulation recently gained attention. To date, no data exist on the function of inhibin α subunit and betaglycan in cystic follicles. In this study, the expressions of inhibin α subunit and betaglycan in cystic follicles were investigated using immunohistochemistry, real-time PCR and Western blot analysis. Both inhibin α subunit and betaglycan immunoreactivities were mainly localized in the granulosa cells of follicles. Expression of inhibin α subunit and betaglycan was inferior in cystic follicles compared with that in normal large follicles. However, the result of enzyme-linked immunosorbent assay showed no significant difference in the decreasing in concentration of inhibin α subunit in cystic follicular fluid compared with the control (P>0.05). In this study, we explored the effects of FSH on betaglycan expression in granulosa cells in vitro. As expected, a significant increase in the expressions of betaglycan mRNA and protein in granulosa cells was observed in response to exogenous FSH (30 ng/ml) (P<0.05) compared with the control. Consequently, this study provides evidence that the expressions of inhibin α subunit and betaglycan are inferior in cystic follicles, and this may be caused by the decrease in FSH in the presence of a cystic follicle.     

不同培养方法及培养密度对绵羊腔前卵泡发育的影响

通过对绵羊腔前卵泡培养方法的研究,能够探索出适宜绵羊腔前卵泡生长发育的培养条件,以及为进一步揭示绵羊卵泡生长发育的规律奠定一些基础。试验一通过使用微滴法和琼脂培养基法培养腔前卵泡,观察其对绵羊腔前卵泡生长的影响;试验二通过绵羊腔前卵泡单独培养与群体培养,探讨不同培养密度对绵羊腔前卵泡生长的影响。试验结果显示,使用微滴法与琼脂培养基法培养的绵羊腔前卵泡,在培养3天时,卵泡直径增加值和存活率差异均不显著(P0.05);但培养6天时,琼脂培养基法培养的腔前卵泡的直径增加值和存活率均极显著高于微滴法培养的腔前卵泡(P0.01);在使用琼脂培养基培养的条件下,对绵羊腔前卵泡进行单独培养和群体培养,在培养的6天时间内二者卵泡直径增加值和存活率差异均不显著(P0.05)。试验结果表明,琼脂培养基法是较为适宜的绵羊腔前卵泡体外培养方法;培养密度对绵羊腔前卵泡体外培养并无显著影响。     

獭兔毛密度变化及毛囊分化研究

为了了解獭兔在不同月龄毛囊和毛密度的变化,选择1～7月龄的獭兔为研究对象,通过活体取样,Sacpic法染色,对不同阶段切片进行观察统计,结果表明:毛密度在1～3月龄处于平台期,无显著变化(P0.05);4～7月龄毛密度处于一个波形变动期,其中通过切片观察5～7月龄为全休止期;4～6月龄为换毛期。本研究摸清了毛密度的变化趋势、变化阶段、各阶段毛囊群特点,为獭兔取皮时间的确定及提高毛密度的研究提供理论支撑。     

绵羊KAP11.1基因克隆、原核表达及皮肤毛囊表达研究

【目的】 对毛囊角蛋白关联蛋白11.1（keratin associated protein 11.1,KAP11.1）基因进行克隆及原核表达,并对KAP11.1基因在不同品种绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,探究KAP11.1基因在南疆地方绵羊品种间表达差异及其对羊毛品质的影响。【方法】 以平原型和田羊、山区型和田羊和卡拉库尔羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以GenBank中绵羊KAP11.1基因序列（登录号：HQ595347.1）为参照设计引物,对KAP11.1基因进行PCR扩增,构建pMD19-T-KAP11.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,经PCR和双酶切鉴定后测序并进行序列分析,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中表达,采用SDS-PAGE和Western blotting检测;利用实时荧光定量PCR技术检测KAP11.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况。【结果】 3种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码159个氨基酸,为不稳定的疏水蛋白。相似性比对结果发现,与参照基因相比,2种类型和田羊基因序列相似性均为99.79％,均在423 bp处发生突变,由C变为T,卡拉库尔羊基因序列相似性为99.38％,其69 bp处G变为T、93 bp处C变为T、423 bp处C变为T。系统进化树分析发现,3种绵羊和山羊亲缘关系最近,和瘤牛亲缘关系最远。KAP11.1蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。试验成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并纯化得到19 ku的KAP11.1蛋白。KAP11.1基因在山区型和田羊和卡拉库尔羊皮肤毛囊中的表达量均显著高于平原型和田羊（P<0.05）,在山区型和田羊和卡拉库尔羊中差异不显著（P>0.05）。【结论】 克隆获得480 bp的绵羊KAP11.1基因CDS区序列,成功构建了pET-28a （+）-KAP11.1原核重组表达质粒,并获得19 ku的KAP11.1蛋白,且KAP11.1基因在3个品种绵羊皮肤毛囊中均有表达。     

The effect of topical minoxidil treatment on hair follicular growth of neonatal hairless descendants of Mexican hairless dogs

The effect of daily topical minoxidil treatment on hair growth was investigated in eight neonatal hairless pups. After 21 days of minoxidil treatment, hair growth occurred in the minoxidil-treated areas of each neonatal hairless pup. The numbers of hairs in the treated areas increased as compared with that in the areas treated with vehicle only. Histological findings revealed that the skin treated with minoxidil contained many hair follicles derived from epidermal ingrowths (hair germs) projecting into the dermis. These hair follicles showed various stages of neofolliculogenesis. After 31 days of treatment, terminal hair growth was observed. In the minoxidil-untreated areas, epidermal ingrowths remained undifferentiated. These results revealed that hairless dogs developed hair growth reactions following minoxidil-treatment when such treatment is applied in the early neonatal period. Neonatal hairless pups are a useful model for evaluating the effectiveness of hair growth stimulators.     

山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集

山羊卵巢腔前卵泡卵母细胞的采集＊芮荣张涌李裕强（西北农业大学发育生物学研究室，陕西杨陵７１２１００）ＣｏｌｅｃｔｉｏｎｏｆＰｒｅａｎｔｒａｌＦｏｌｉｃｕｌａｒＯｏｃｙｔｅｓｆｒｏｍＧｏａｔＯｖａｒｉｅｓＲｕｉＲｏｎｇＺｈａｎｇＹｏｎｇＬｉＹｕｑｉａｎ...     

猪卵泡形成中后期卵母细胞发育和闭锁变化的超微结构研究

本文采用了电镜观察猪卵泡形成中后期卵母细胞(OC)的超微结构,其结果有两种变化:一是进行性变化,其核在排出第一极体以前,都处于生发泡阶段。细胞质内含大量脂滴(Li),线粒体(Mi)和内质网(ER)囊泡集群分布于近皮质区;随OC 的增大,皮质颗粒(CGs)的直径、分布密度都增加,但膜距减少。微绒毛(MV)数量、直径和长度逐渐变少、变粗、变短,极少见到高尔基复合体(Go)。颗粒细胞(GC)逐渐老化。二是闭锁变化,其核膜皱折,染色质浓缩,Mi 互相融合并出现空泡。ER 囊扩大融合,Li 减少,核蛋白体和糖元颗粒不清,卵膜皱缩,与透明带间出现大的裂隙。GC 质中出现空泡,核膜破裂。GC 数量减少,严重的完全消失。统计分析表明,卵泡直径5mm 时其闭锁率最高。     

AREG对绵羊卵丘细胞葡萄糖代谢的影响

为研究双调蛋白(AREG)对绵羊卵丘细胞(Cumulus cells,CCs)葡萄糖代谢的影响,采集来源于中腔卵泡和小腔卵泡的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),利用荧光定量PCR检测中、小腔卵泡卵丘细胞葡萄糖代谢相关基因表达;添加AREG进行卵丘细胞的体外培养和卵母细胞的体外成熟(IVM),检测卵丘细胞的增殖,测定培养液或细胞中的葡萄糖、乳酸、NADPH和ATP含量。结果表明:1)来源于小腔卵泡的卵丘细胞G6PDH、PFKL和PFKM的mRNA表达量以及细胞增殖能力显著低于中腔卵泡卵丘细胞(P<0.05);2)较低浓度(10 ng/mL)的AREG显著提高了中腔卵泡卵丘细胞的增殖能力(P<0.05)而对小腔卵泡卵丘细胞无影响(P>0.05),在生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)的协同作用下,10 ng/mL AREG可以显著提高两者的增殖能力(P<0.05)且两者间差异不显著(P>0.05);3)在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可显著提高不同直径腔卵泡卵丘细胞培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成、NADPH生成以及细胞中的ATP含量(P<0.05);4)小腔卵泡卵母细胞的IVM培养液中添加AREG+GDF9+BMP15,显著提高培养液中的葡萄糖消耗、乳酸生成及卵丘细胞中的ATP含量(P<0.05)且显著高于中腔卵泡(P<0.05),显著提高了卵母细胞中的NADPH生成及ATP含量(P<0.05)且与中腔卵泡卵母细胞组差异不显著(P>0.05)。综上,在GDF9和BMP15的协同作用下,AREG可以增强绵羊卵丘细胞的葡萄糖代谢,并且对进行IVM的小腔卵泡COCs添加AREG+GDF9+BMP15可使其葡萄糖代谢达到中腔卵泡的水平。     

促性腺激素诱发大西洋鲑卵黄发生期卵巢滤泡释放性类固醇激素的离体研究

提要应用大麻哈鱼(Oncovhynchus keta)促性腺激素(GTH)诱发大西洋鲑(Salmosalar)卵黄发生期的离体卵巢滤泡(直径为3．4毫米)产生性类固醇激素的研究表明，不论用0．1或1微克／毫升GTH刺激，经培育10天后，未出现卵母细胞卵核消失的现象，卵核偏位也不明显。对培养液中17α，20β-双羟孕酮(17α20βP)的积累浓度测定结果，仅1微克／毫升GTH组含少量的17α20βP；0．1微克／毫升GTH组，培养液中雌二醇的积累浓度明显高于对照组和1微克／毫升GTH组，并为后者的两倍。除雌二醇外，孕酮，17α-羟孕酮，17α20βP，雄烯二酮和睾酮的产生，都呈现对GTH剂量的依赖关系，1微克／毫升GTH组的产生量明显高于0．1微克／毫升GTH组和对照组。离体研究的结果表明，处于卵黄发生期的卵巢滤泡对低剂量(0．1微克／毫升)和高剂量(1微克／毫升)GTH的反应不同。低浓度的GTH，引起性类固醇激素生物合成的途径沿着形成雌二醇的方向进行，雄激素被芳香化成雌激素，雌二醇再而刺激肝脏合成卵黄物质的前体，从而促进卵黄发生。高浓度的GTH，有抑制雌二醇合成的作用，而是促使卵母细胞向着最终成熟的方向发展，使性类固醇生物合成的途径转向形成大量雄激素和孕激素，特别是17α20βP。这与已充分生长和卵黄积累完成的卵巢滤泡离体试验的结果一致，与活体观察以上各种性类固醇激素的变化一致。     

NPFFR1基因对鹅卵泡颗粒细胞激素分泌和细胞凋亡的影响研究

神经相关肽受体（RFamide-related peptide receptor,NPFFR1）是促性腺激素抑制激素的主要亲和受体,它在调控动物繁殖方面起着重要作用。为了解NPFFR1对鹅卵巢卵泡发育的作用,本研究以42周龄健康产蛋四川白鹅为试验材料（n=9）,利用RT-qPCR法检测NPFFR1基因在等级前和等级卵泡颗粒细胞中的mRNA表达规律;在颗粒细胞中过表达NPFFR1基因,酶联免疫吸附法检测颗粒细胞上清液（n=9）中雌二醇（estradiol,E2）、孕酮（progesterone,P4）和抗缪勒管激素（anti-Mullerian hormone,AMH）的浓度变化,剩余贴壁细胞作一步法TUNEL检测细胞凋亡情况;转录组测序方法筛选大黄卵泡（8~10 mm）颗粒细胞过表达NPFFR1前后表达差异显著基因,并对差异表达基因进行功能聚类分析。结果显示,除F1等级外,其余等级卵泡颗粒细胞NPFFR1表达量均极显著高于等级前卵泡（P<0.01）;过表达NPFFR1后,等级颗粒细胞上清液中的E2和等级前颗粒细胞上清液AMH的含量显著（P<0.05）降低,但孕酮P4含量变化不显著（P>0.05）;转录组测序共筛选到267个差异表达基因（119个下调,148个上调）,这些基因主要富集在生物节律过程、繁殖进程等生物学过程中;同时,与对照组相比,差异基因AMH显著下调表达（P<0.05）,Clock（clock circadian regulator）、FOS（proto-oncogene,AP-1 trans-cription factor subunit）、Per（period circadian regulator）和ANTXR2（cell adhesion molecule 2）分别极显著（P<0.01）或显著（P<0.05）上调表达。上述试验结果提示,NPFFR1可从激素、细胞凋亡和生物节律等多个环节影响卵泡颗粒细胞,参与调控卵泡的时序等级发育。